Manipulations pour la micro-injection chez Biomphalaria glabrata
<ol> <li><strong>Production des œufs </strong></li> </ol> <p>Mettre dans des aquariums de 5.5L une trentaine d'escargots adultes (10 mm). Mettre un pondoir (morceau de polystyrène de 3 x 3 cm) dans chaque aquarium, c’est le substrat préféré pour faire pondre <em>Biomphalaria glabrata</em>. Les escargots sont nourris <em>ad libitum</em> avec de la salade (des feuilles laitue sans côtes), ils peuvent aussi être nourris avec de la spiruline sèche pour booster la reproduction. Maintenir les aquariums à une température de 25 degrés.</p> <ol> <li><strong>Collection d’œufs </strong></li> </ol> <p>Prenez délicatement plusieurs pontes d’œufs déposées sur les polystyrènes avec des pinces souples et placez les œufs dans une boîte de pétri avec de l’eau minérale naturelle (Volvic de préference) afin d’éviter qu’ils ne sèchent. </p> <p>Commencez à trier les œufs sous la loupe binoculaire pour choisir seulement le stade gastrula et placez-les dans une autre boîte de pétri avec de l’eau minérale naturelle. </p> <p> </p> <ol> <li><strong><em>Préparation de la solution de transfection</em></strong></li> </ol> <p><strong>Matériel :</strong></p> <ol> <li>Réactif de transfection<em> in vivo </em>jetPEI</li> <li>Solution de glucose 10%</li> <li>Solution de glucose 5% </li> <li>Plasmides (dCas9-SunTag-BFP et scFv-DNMT3A-GFP) </li> <li>Microtubes de 0.2 ml</li> <li>Pipettes P10 et P200</li> <li>Pointes de pipettes P10 et P200</li> <li>Marqueur permanent</li> </ol> <p>La solution de glucose et le réactif de transfection <em>in vivo jetPEI</em> sont équilibrés à température ambiante. Préparez 21 µl de chaque plasmide (dCas9-SunTag-BFP et scFv-DNMT3A-GFP) à une concentration de 78.8 et 88.8 ng/µl respectivement (pour un volume total de 42 µl = 3.5 µg d’ADN), ajoutez l’ensemble à un tube de 0.2ml avec 21 µl de solution de glucose à 10% (étiqueté Tube A). </p> <p> </p> <p>Dans un autre tube de 0.2ml (étiqueté Tube B), 21 µl de solution de glucose à 5% et 1 µl de <em>in vivo jetPEI</em> sont ajoutés. Préparez un autre tube (étiqueté Tube C) avec 21 µl de solution glucose à 5% et 0.5 µl de <em>in vivo jetPEI</em> pour injecter dans des embryons qui serviront de témoins. Laissez les solutions à température ambiante pendant que vous préparez le poste de micro-injection.</p> <p> </p> <ol> <li><strong>Préparation du poste de micro-injection</strong></li> </ol> <p> </p> <p><strong>Matériel :</strong></p> <ol> <li>Micropipettes en verre de 1 mm de diamètre étirées</li> <li>Verre de montre</li> <li>Pâte à modeler</li> <li>Boîtes de pétri 35 mm et 90 mm</li> <li>Huile minérale (M5904, SIGMA)</li> <li>Pissette avec de l’eau minérale naturelle (Volvic)</li> <li>Microtubes de 0.2 ml</li> <li>Plaque de culture cellulaire 12 puits</li> <li>Pinceau fin</li> <li>Solution de rouge de phénol</li> <li>Pipette Pasteur</li> <li>Forceps à dissection</li> <li>Pinces souples</li> <li>Pontes d’œufs d’escargots au stade gastrula</li> <li>Injecteur de nanolitre programmable Drummond Scientific Nanoject III</li> </ol> <p>Prenez une micropipette préalablement étirée et coupez-la avec un scalpel pour obtenir une pointe d’environ ~0.2 mm légèrement biseautée si possible.</p> <p>Avant de fixer la micropipette à l’injecteur de nanolitre programmable, la remplir d’huile minérale, sans huile minérale à l’intérieur, elle ne fonctionnera pas correctement. Cela peut être réalisé avec une aiguille de remplissage et une seringue hamilton de 10 µl.</p> <p>Lorsque la micropipette est remplie d’huile il faut la fixer sur l’injecteur, pour cela il faut glisser le mandrin et la pince de serrage sur la micropipette en verre étirée, glisser ensuite le joint d’étanchéité le long du piston, puis le positionner.</p> <p>Une fois la micropipette fixée sur l’injecteur, appuyer sur l’icône [EMPTY] jusqu’à ce que le piston soit complètement allongé, cette étape peut être effectuée avec l’interrupteur à pédale en appuyant une fois sur [EMPTY] puis sur [STOP] puis en procédant à vide avec l’interrupteur à pédale. Un seul bip est émis lorsque le piston est complètement allongé. </p> <p>Remplir la micropipette avec 3 µl de la solution contrôle ou la solution contenant les plasmides (c’est-à-dire la solution de transfection) en plaçant la pointe de la micropipette en verre dans un tube de 0.2 ml avec la solution à injecter et en appuyant sur l’icône [FILL]. Il est souhaitable de la remplir à un débit lent, en appuyant sur l’icône [FILL] pendant quelques secondes, puis sur l’icône [STOP] pour permettre à l’échantillon de s’équilibrer avant d’appuyer de nouveau sur l’icône [FILL]. </p> <p>Remarque : le piston continue de s’allonger ou de se rétracter jusqu’à ce que l’on appuie sur l’icône [STOP], ou jusqu’à ce que la position pleinement allongée ou pleinement rétractée soit atteinte. </p> <p> </p> <ol> <li><strong>Microinjection</strong></li> </ol> <p>Placez un verre de montre dans une boîte de pétri de 35 mm et fixez le d’un côté avec de la pâte à modeler pour forme une pente. Utilisez une pince souple pour transférer une masse d’œufs et posez-la sur le côté de la pente du verre de montre pour que la masse d’œufs soit dans une position inclinée. </p> <p>Enlevez l'excédent d'eau de l'œuf avec du papier absorbant contre le côté opposé aux œufs. Réhydratez si nécessaire avec un pinceau fin pour améliorer la visibilité des embryons. Pour injecter l’échantillon, retourner à l’écran du mode de fonctionnement en appuyant sur l’icône [EXIT], puis sélectionner le mode d’injection en appuyant sur l’icône [INJECT]. </p> <p>Régler le volume d’injection à 30nL et le débit à 20 nL par seconde en utilisant les icônes [+] et [-] respectivement. Appuyez sur l’icône [INJECT] pour injecter l’échantillon.</p> <p>Injectez 30nL de la solution de micro-injection dans chaque œuf. Placez les masses d’œufs micro-injectés dans une plaque de culture cellulaire de 12 puits et notez avec un marqueur s’ils ont été micro-injectés avec la solution de contrôle ou avec la solution contenant les plasmides. </p> <p>Notez que nous avons coloré avec du rouge phénol la solution d’injection pour faciliter la visibilité dans cette vidéo. </p> <p><strong>Monitorer l’expression des plasmides </strong></p> <p>Monitorez l’expression des plasmides 72 h après la micro-injection dans un microscope de contraste/fluorescente ou une loupe binoculaire fluorescente. Puis triez les escargots fluorescents et réalisez une deuxième micro-injection avec une solution contenant 10 µl d’ARN guide (2ng/µl), ainsi que 0.5 µl de réactif <em>in vivo jetPEI </em>et 10 µl de glucose 5%. 3 jours après la deuxième microinjection, récupérez les escargots éclos dans des tubes 1.5 ml contenant 25 µl du tampon de lyse pour une purification d’ADN et ARN.</p> <p>Pour cette photo élaborée au microscope confocal nous avons lavé une larve véligère dans une solution du PBS puis nous l’avons fixé avec une solution du paraformaldéhyde à 4% et ensuite nous l’avons mis dans une lame avec deux gouttes du milieu de montage de fluorescence Dako.</p> <p>96 heures après la transfection on peut observer l’expression de la protéine verte fluorescente, de la protéine bleue fluorescente et la co-localization des deux protéines. </p> <p>Ce protocole sert à effectuer des modifications de la méthylation de l’ADN dans un gène cible. Ce protocole de transfection peut être utiliser avec d’autres plasmides, avec des petits ARN interférents ou avec des ARN messagers. </p> <p>Produit de IHPE (http://ihpe.univ-perp.fr).</p>
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Overall dataset sharing score
Score breakdown
These five areas show where the dataset supports — or may limit — practical reuse.
- Stewardship
- 4
- Harmonization
- 4
- Access
- 16
- Reuse readiness
- 8
- Engagement
- 4
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